Simulador: composición de la fase móvil en HPLC isocrático

Fase reversa en C18, elución isocrática, mezcla de nueve conservantes (ácidos benzoico y sórbico y siete parabenos). Movés el % de acetonitrilo de la fase móvil y aparece el compromiso: con poca fase orgánica (ACN) la corrida se alarga y dos isómeros se juntan; con mucho, la corrida se acorta y otro par se superpone. La ventana donde todo resuelve es angosta: buscala con el slider.

1 Acetonitrilo (ACN) en la fase móvil — empezá por acá: mové el slider y mirá los picos →

30,0 % ACN / 70,0 % agua con buffer

25 %60 %

Condiciones fijas · Columna C18 250 × 4,6 mm, 5 µm · 30 °C · 1,0 mL/min · fase acuosa: agua con buffer acetato 20 mM pH 4,3 · isocrático · UV 254 nm

2 Mirá el cromatograma

Vista general · corrida completa

Criterio (resolución Rs): Rs ≥ 1,5 separados a línea de base · 1,0 a 1,5 separación parcial: los picos se tocan · Rs < 1,0 se superponen; cerca de 0, coeluyen

Zoom del par crítico

Selectividad α

k promedio

Resolución Rs

Compuesto	k	t_R (min)	Rs con el anterior

¿Qué es k? El factor de retención: k = (t_R − t₀) ⁄ t₀, donde t₀ es lo que tarda en salir algo que no se retiene (acá, 2,4 min). Mide cuánto tiempo pasa el compuesto retenido en la fase estacionaria por cada minuto que viaja con la fase móvil. Con k = 1 sale al doble de t₀; con k = 10, a once veces t₀. Por debajo de k ≈ 1 el pico sale pegado al frente, junto con lo que no se retiene. A diferencia de t_R, k no depende del caudal ni del largo de la columna: depende de la química (fase móvil, fase estacionaria, temperatura).

Diseño: AGS Analítica S.A.® Revisado técnicamente · Última actualización: oct. 2026

1 Qué estás cambiando

Corrida · a 25 % ACN ·

2 Qué les pasa a los picos

Detrás del cromatograma Opcional

Por qué los picos se cruzan, y cómo armar este mapa para tu propia mezcla con dos corridas. No hace falta para usar el simulador: abrilo cuando quieras profundizar.

Cada recta es un compuesto: log k versus % de acetonitrilo. La línea vertical es tu fase móvil y se mueve con el slider. Donde dos rectas se cruzan, esos dos compuestos coeluyen. La franja de arriba muestra qué par limita la separación en cada tramo, con el mismo color que la banda del cromatograma y el zoom.

Cómo armar este mapa para tu mezcla

No hace falta software: alcanza con dos corridas isocráticas y una planilla de cálculo.

Dos corridas a distinto % de orgánico, separadas por 10 a 15 puntos (por ejemplo, 35 y 45 %), elegidas para que todos los picos salgan con k entre ~1 y ~20. Misma columna, temperatura y fase acuosa.
Medí t₀ con la perturbación de solvente o con un marcador no retenido (por ejemplo, uracilo), y calculá k = (t_R − t₀) ⁄ t₀ para cada compuesto en cada corrida.
Graficá log k contra el %: dos puntos por compuesto dan su recta. Una tercera corrida intermedia confirma que es una recta y no una curva.
Leé el mapa: dónde se cruzan o se acercan las rectas y en qué % el par crítico queda más separado. Para estimar la resolución: Rs ≈ (√N ⁄ 4)·(α − 1)·k ⁄ (1 + k), con N de un pico de tu corrida: N = 5,54·(t_R ⁄ w_½)².
Confirmá con una corrida real al % elegido.

Con una sola corrida: como regla general, para moléculas chicas k cambia unas 2 a 3 veces cada 10 puntos de orgánico (la «regla del 3»). Sirve para estimar hacia dónde moverte, no para predecir cruces: para eso hacen falta las pendientes de cada compuesto.

Límites: interpolar entre las corridas es confiable; extrapolar lejos, no. Con analitos ionizables, el pH tiene que quedar fijo. El mapa vale para esa columna y esas condiciones: con otra marca de C18 o con metanol en lugar de acetonitrilo, hay que volver a medirlo.

¿Por qué más retención no siempre separa mejor? Bajar el % de acetonitrilo aumenta k de todos los compuestos, pero no en la misma proporción: cada uno tiene su propia pendiente. Si dos compuestos tienen pendientes distintas, la selectividad entre ellos cambia con la fase móvil y puede llegar a invertirse el orden de elución. Con nueve compuestos, la ventana isocrática que resuelve todo es de apenas un par de puntos de %: un error chico al preparar la fase móvil ya la saca de especificación. Es la razón habitual para pasar a un gradiente.

Sobre el modelo. La retención sigue la relación lineal entre log k y la fracción de fase orgánica (ACN) en la fase móvil (log k = log k_w − S·φ), con t_R = t₀(1 + k) y t₀ = 2,4 min. A 40 % de ACN, los tiempos de retención están anclados en datos experimentales de esta mezcla en una C18 de 250 × 4,6 mm, con una precisión de ±0,1 min. Las pendientes S son ilustrativas: se ajustaron para que el comportamiento a 30 y a 50 % de ACN sea coherente con lo observado experimentalmente y con notas de aplicación de parabenos en columnas C18 de distintos fabricantes. Los puntos exactos donde se cruzan las rectas son extrapolaciones del modelo, no mediciones.

La eficiencia se fijó en N = 20.000 platos para todos los picos, y las alturas relativas son ilustrativas. No se simulan el ensanchamiento extracolumna, la forma real de los picos (tailing), la temperatura ni el pH: el pH queda fijo en 4,3, que es justamente lo que separa al ácido benzoico del sórbico. Con otra marca de C18, la retención puede cambiar bastante, aun con la misma fase móvil. Verificá siempre experimentalmente.